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        大鼠T淋巴細胞亞群CD4+(CD4)ELISA檢測試劑盒說明書

        發布時間: 2021-02-19  點擊次數: 298次

          大鼠T淋巴細胞亞群CD4+(CD4)ELISA檢測試劑盒說明書

        檢測原理

        試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被T淋巴細胞亞群CD4+(CD4)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的T淋巴細胞亞群CD4+(CD4)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。

        樣品收集、處理及保存方法

        1.  血清:使用不含熱原和內毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

        2.  血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

        3.  細胞上清液:3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

        4.  組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。

        5.  保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

        自備物品

        • 酶標儀(450nm
        • 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
        • 37℃恒溫箱

        操作注意事項

        1.   試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶,這屬于正?,F象,水浴加熱使結晶完全溶解后再使用。
        2.   實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
        3.   預處理后的樣本無需稀釋,直接取10μL加樣即可。
        4.   嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
        5.   所有液體組分使用前充分搖勻。

        試劑盒組成

        名稱

        96孔配置

        48孔配置

        備注

        微孔酶標板

        12×8

        12×4

        標準品(400 ng/ml

        0.5mL

        0.5mL

        按說明書進行稀釋

        標準品稀釋液

        6mL

        3mL

        按說明書進行稀釋

        樣本稀釋液

        6mL

        3mL

        按說明書進行稀釋

        檢測抗體-HRP

        6mL

        3mL

        20×洗滌緩沖液

        20mL

        20mL

        按說明書進行稀釋

        底物A

        6mL

        3mL

        底物B

        6mL

        3mL

        終止液

        6mL

        3mL

        封板膜

        2

        2

        說明書

        1

        1

        自封袋

        1

        1

        注:標準品用標準品稀釋液依次稀釋為:400、200、100、50、25、0ng/ml.

        試劑的準備

         20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按120稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

        洗板方法

        1.   手工洗板:甩盡孔內液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。
        2.   自動洗板機:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

        操作步驟

        1.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
        2.   設置標準品孔、樣本孔和空白孔,空白孔什么都不加;標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;
        3.   待測樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;
        4.   隨后標準品孔和樣本孔中(空白孔不加)加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體50μL,用        封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
        5.   棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
        6.   所有孔加入底物A、B50μL,37℃避光孵育15min。
        7.   所有孔加入終止液50μL,15min內,在450nm波長處測定各孔的OD值。

        結果判斷

         繪制標準曲線:在Excel工作表中,以標準品濃度作橫坐標,對應OD值作縱坐標,繪制出標準品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。

         

        試劑盒性能

        •  準確性:標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值,大于等于0.9200。
        •  靈敏度:可以檢測濃度小于1.0 ng/ml。
        •  特異性:不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
        •  重復性:板內、板間變異系數均小于15%。
        •  貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
        •  有效期:6個月
        •  檢測范圍:6.25ng/ml -400ng/ml

        免責聲明

        •   試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實驗或體實驗,否則所產生的一切后果,由實驗者承擔,本公司概不負責。
        •   嚴格按照說明書操作,不同批號不可交換使用,實驗者違反說明書操作,后果由實驗者承擔。

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